فهرست مطالب

عنوان صفحه

چکیده1

فصل اول «مقدمه و طرح تحقیق»

1-1- مقدمه3

1-2- بیان مسئله4

1-3- مروری بر سابقه تحقیق4

1-4- اهداف، فرضیات و سوالات تحقیق6

1-4-1- اهداف تحقیق6

1-4-1-1- هدف کلی6

1-4-1-2- اهداف جزئی6

1-4-2- فرضیات تحقیق6

1-4-3- سئوالات تحقيق6

1-5- روش تحقیق و پژوهش7

فصل دوم « کلیات »

انگل‌ها و بیماری‌های طیور و سایر پرندگان9

2-1- انگلهای خارجی9

2-1-1- ساسها9

2-1-2- شپشهای گزنده9

2-1-3- مگسهای سیاه10

2-1-4- مایت‌های ماکیان10

2-1-5- لارومایت ها10

2-1-6- سوسک بستر و لارو آن آلفیتوبیوس دپاپرینوس11

2-1-7- مایت‌های پر و مایت‌های ایجادکننده پرریزی11

2-1-8- مایت‌های زیر پوستی11

2-2- انگل‌های داخلی12

2-2-1- کیسه ملتحمه12

2-2-2- نای13

2-2-4- پیش معده14

2-2-5- سنگدان14

2-2-6- روده باریک15

2-2-7- روده کور16

2-2-8- پوست17

2-3- بیماری‌های انگلی طیور17

2-3-1- کوکسیدیوز17

2-3-2- کریپتوسپوریدیوز20

2-3-3- هگزامیتیازیس24

2-3-4- هیستومونیازیس27

2-3-5- لکوسیتوزئونوز32

2-4- واکنش زنجیر‌های پلی مراز( PCR )35

2-4-1- مواد و وسایل لازم برای انجام برای انجام آزمایش PCR36

2-4-2- سنتز36

2-4-3- تشخیص و تجزیه فراورده‌های PCR:37

فصل سوم «مواد و روش کار»

3-1- نمونه گیری40

3-2- استخراج DNA از کبد با استفاده از کیت40

3-3- استخراج DNA از خون با استفاده از کیت41

3-4- آزمایش PCR42

3-4-1- روش کار42

3-5- تهيه ژل آگارز43

3-5-1- مواد و وسايل لازم43

3-5-2- روش تهيه بافر (1X) TBEبراي تهيه ژل آگارز44

3-5-3- روش تهيه ژل آگارز44

3-5-4- روش انجام الکتروفورز44

3-5-5- آنالیز محصول PCR:45

3-6- آزمایشات هیستوپاتولوژی45

3-6-1- رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) :45

3-6-2- روش رنگ آمیزی اسلاید با رنگ (H&E) :46

3-6-3- تفسیر رنگ آمیزی (H&E)47

3-6-4- نتایج رنگ آمیزی (H&E)48

فصل چهارم « نتایج »

4-1- نتایج کیفی مربوط به استخراج DNA50

4-2- نتایج آزمایشات هیستوپاتولوژی51

فصل پنجم « بحث و نتیجه گیری »

5-1- بحث53

5-2- پیشنهادات56

منابع57

فهرست شکل‌ها

عنوان صفحه

شکل 4-1- الکتروفورز محصولات PCR به منظور تکثیر ژن انگل هیستومونیازیس در نمونه‌های خون و کبد بوقلمون بر روی ژل آگارز 1%.50

شکل 4-2- مشاهده مقاطع انگل هیستوموناد در بین هپاتوسیت‌های کبدی.51

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 4-1- مقایسه روش ردیابی از طریق PCR و آزمایشات هیستوپاتولوژی51

 

چکیده

به منظور ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون‌های کشتار شده در استان اصفهان، 200 نمونه خون و 200 نمونه کبد در کشتارگاه اخذ شد و پس از استخراج DNA، قطعه 550 جفت بازی مربوط به ژن 18SRNA تکثیر شد. علاوه بر آن، نمونه‌های کبد در فرمالین 10% نگهداری و پس از تهیه مقاطع پاتولوژی رنگ آمیزی با هماتوکسیلین - ائوزین از نظر وجود انگل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج PCR نشان داد از 200 نمونه خون، 18 نمونه (9%) و از تعداد 200 نمونه کبد، 32 نمونه (16%) از لحاظ هیستوموناس مله اگریدیس مثبت می‌باشد. نتایج هیستوپاتولوژی نشان داد از بین نمونه‌های PCR مثبت 76/11 % در هیستوپاتولوژی مثبت ارزیابی شدند لذا به نظر می‌رسد برای شناسایی هیستوموناس مله اگریدیس PCR از ویژگی بالایی برخوردار می‌باشد.

کلید واژه‌ها : بوقلمون، هیستوموناس مله اگریدیس، PCR، اصفهان.

 

فصل اول

مقدمه و طرح تحقیق»

 

1-1- مقدمه

در دهه‌های اخیر به دلیل رشد جوامع بشری، نیاز به منابع غذایی به خصوص اقلام پروتئینی حیوانی افزایش یافته است وپرورش بوقلمون به طور صنعتی به منظور رفع بخشی از این نیاز در سراسر جهان درحال گسترش می‌باشد.درسال2004 ایالات متحده باتولید 2592000 تن گوشت بوقلمون در رتبه نخست بوده است.درکشور ما نیز پرورش بوقلمون صنعتی در سال‌های اخیر رشد قابل توجهی داشته به طوری که تولید گوشت آن به صور مختلف قطعه بندی شده ویا لاشه قابل عرضه می‌باشد (5).

در ایران صنعت پرورش بوقلمون از سال1355 آغاز گردیده وهرساله به تعداد مزارع بوقلمون درکشور اضافه می‌شود (1).

باتوجه به خصوصیات پرورشی مناسب بوقلمون‌های گوشتی، نظیر میزان وزن گیری، سرعت رشد زیاد (74/10 کیلوگرم در16 هفتگی برای بوقلمون‌های ماده و 39/20 کیلوگرم در20 هفتگی برای بوقلمون‌های نر) ضریب تبدیل غذایی پایین،درصد اندک افت لاشه وارزش غذایی مناسب در مقایسه سایر طیور صنعتی،پرورش این پرنده به طور صنعتی به منظور رفع بخشی از این نیازها در سراسر جهان درحال گسترش است به طوری که در سال 2007 ایالات متحده، اتحادیه اروپا، برزیل و کانادا ازنظر تولید گوشت بوقلمون درسطح جهان به ترتیب دررتبه‌های اول تا چهارم قرار داشتند (7).

 

1-2- بیان مسئله

هیستومونیازیس [1] بیماری تک یاخته‌ای حاد است. هیستوموناس مله اگریدیس[2]تک تاژک است. تک‌یاخته‌های انگلی باعث هپاتیت سکوم می‌شوند.سایت‌های هجومی این انگل سکوم و کبد می‌باشد واختلال گردش خون درمراحل بعدی این بیماری به نظر می‌رسد وباعث یک بیماری سرسیاه در پرنده می‌شود.

در دهه‌های اخیر هیستومونیازیس موجب شده است تا آسیب جدی به صنعت طیور، به ویژه در میان بوقلمون وارد شود. موارد کمی از بروز بیماری در ماکیان نیز گزارش شده است ولی ماکیان به علت مقاومت در مقابل بیماری، بیشتر نقش مخزن بیماری را داشته و در صورت آلودگی به کرم هتراکیس گالیناروم[3]، نقش مهمی در انتقال بیماری به بوقلمونها بازی می‌نمایند. جوجه بوقلمونها با خوردن تخمهای آلوده هتراکیس به بیماری مبتلا می‌شوند. این بیماری انتشار جغرافیایی وسیعی در دنیا دارد. مشاهدات درمانگاهی وکالبدگشایی در ایران نشان دهنده‌ی حضور بیماری می‌باشد (29).

 

1-3- مروری بر سابقه تحقیق

در مطالعه‌ای که توسط Cortes و همکاران (2004) در گله جوجه‌های تجاری با 6 هفته سن صورت گرفت نشان داد علائم کلینیکی شامل افسردگی و با آب و تاب راه رفتن، بی علاقگی وافزایش اندکی در مرگ و میر دارند. این اولین گزارش از حضور هیستومونیازیس در بورس فابرسیوس در جوجه‌های تجاری است (10).

در مطالعه‌ای دیگر که توسط Hurst (1980) با موضوع بررسی هیستومونیازیس در بوقلمون‌های وحشی در می‌سی سی پی آمریکا صورت گرفت، نشان داد در جمعیت بوقلمون‌های وحشی با تراکم بالا، انگل هیستومونیازیس وجود دارد (19).

در مطالعه‌ای دیگر که توسط Lotfi و همکاران (2012) انجام شد نشان داد انگل هیستومونیازیس در خارج از بدن میزبان به طور خیلی ضعیف زنده می‌ماند. این بررسی در شرایط مشابه مزرعه و در دمای اتاق بر روی چند ماده مصنوعی انجام گرفت که نتایج آن شامل: تک یاخته تا یک ساعت بر روی چوب، لاستیک وفلز، تا 3ساعت در جعبه‌های تخم مرغ، پوسته‌های تخم مرغ وآجر، تا 6ساعت در پر و بال و خوراک بوقلمون و تا 9 ساعت در آب لوله کشی کلر نزده و مدفوع زنده می‌ماند. بنابراین آب آلوده و مدفوع تازه و یا هر دو می‌توانند نقش مهمی در انتقال انگل بازی کنند (24).

در مطالعه‌ای که توسط McDougald (2005) با موضوع هیستومونیازیس در پرندگان در رودایسلند انجام شد نشان داد که بیماری سر سیاه باعث مرگ و میر بالا در بوقلمون‌ها گاهی نزدیک به 100 درصد ودر جوجه‌ها میزان مرگ و میر ممکن است با عوارض بالا از 20 تا 100 درصد همراه باشد. دراین تحقیق نشان داده شد هیستومونیازیس به سرعت در گله‌ی بوقلمون از طریق تماس مستقیم پرندگان با یکدیگر پخش می‌شود و احتمالأ مربوط به پدیده کلوآک نوشی است. در این تحقیق بر وابستگی به هتراکیس گالیناروم به عنوان منبع عفونت ذکر شده است (29).

در مطالعه دیگر که توسط Patra و همکاران (2013) در هند با هدف شناسایی میزان بروز هیستومونیازیس در پرندگان گوشتی از طریق مولکولی انجام شد نشان داد از 4000 پرنده مورد بررسی قرار گرفته 40 پرنده به هیستومونیازیس مله آگریدیس مبتلا بودند یا به عبارتی میزان شیوع 1 درصد بود (32).

در گزارشی که توسط Popp و همکاران (2011) انجام شد نشان داد که مزرعه‌ای ارگانیک در جنوب آلمان به مدت 3 سال متوالی در میان جوجه‌های گوشتی و بوقلمون‌ها، شیوع یک بیماری شدید ناشی از انگل تک یاخته هیستومونیازیس مله اگریدیس رخ داده است و تشخیص از طریق DNA بوده است (33).

در مطالعه‌ای دیگر که توسط Senties-Cue و همکاران (2009) انجام شد نشان داد در بوقلمون‌هایی با سن 7 تا 13 هفتگی علایمی همچون بی اشتهایی، افسردگی، اسهال، از دست دادن وزن و افزایش مرگ و میر داشتند. علائم کالبدگشایی آن شامل ضخیم شدن شدید دیواره سکوم، بزرگ شدگی بورس، پانکراس و طحال کم رنگ و زرد بود. میکروسکوپ الکترونی حضور هیستومونیازیس در کبد و سکوم را تایید کرد. این اولین گزارش حضور سیستمیک هیستومونیازیس موثر بر بورس فابرسیوس، کلیه‌ها، ریه، پانکراس و پیش معده در بوقلمون است (38).

 

1-4- اهداف، فرضیات و سوالات تحقیق

4-1- اهداف تحقیق

-4-1-1- هدف کلی

ردیابی انگل هیستوموناس مله آگریدیس در گله‌های بوقلمون استان اصفهان به روش PCR

 

1-4-1-2- اهداف جزئی

برآورد میزان فراوانی

 

1-4-2- فرضیات تحقیق

هیستومونیازیس دربوقلمون‌های اصفهان وجوددارد.

 

1-4-3- سئوالات تحقيق

آیا هیستومونیازیس در بوقلمون‌های اصفهان وجود دارد؟

 

1-5- روش تحقیق و پژوهش

الف : نمونه گیری :

به منظوربررسی آلودگی Histomoniasis Meleagridisدرگله‌های بوقلمون استان اصفهان، بامراجعه به کشتارگاه بوقلمون واقع دراستان اصفهان شامل شهرستانهای تیران و کرون و نجف آباد 200 نمونه خون و 200 نمونه کبد از 20 گله بوقلمون اخذ ونمونه‌ها درکنار یخ به آزمایشگاه منتقل گردید وتا زمان انجام آزمایشات دردمای20- درجه سانتی گراد نگه داری شد.

ب : استخراج DNA

نمونه خون وکبد پس از هموژن سازی با استفاده از کیت تخلیص DNA (Korea،(Bioneer استخراج می‌گردد.

[1]- Histomoniasis

[2]- Histomonas meleagridis

[3]- Heterakis gallinarum